https://hdl.handle.net/2238/10505 Thu, 21 May 2026 02:54:36 GMT 2026-05-21T02:54:36Z https://hdl.handle.net/2238/13916 Validation of succination targets and its effects on Escherichia Coli Navarro-Porras, María José Succination is a non-enzymatic and covalent PTM of cysteine by the TCA cycle metabolite fumarate, which results in the formation of S-(2-succino)cysteine (2SC), a mitochondrial stress indicator. It causes wide-ranging effects on eukaryotic metabolism, but has not been well-established for prokaryotic organisms. Therefore, the aim of this project is to validate in E. coli some succination targets previously revealed by proteomics, of which some are proteins with Fe-S clusters. The experiments were elaborated according to two methodologies, using Dimethyl Fumarate (DMF), its active compound Monomethyl-Fumarate (MMF), and fumarase depletion ΔfumABC mutant to drive fumarate accumulation. It was demonstrated that supplementation with glutamine, adenine and xanthine (GAX) was able to overcome the toxic effect of DMF on the mutants at sub-MIC of the drug. Also, a ΔfumABC mutant manages to recover a growth rate similar to the WT strain when supplemented with GAX. For the second part, enzymatic assays were performed to measure the specific activity of fumarase and aconitase. The Fe-S proteins decreased their enzymatic activity when exposed to DMF and fumarase depletion treatments. Among all, Fe-S clusters appear to have a protecting role from succination on their coordinating cysteines. The results obtained contribute to the evidence that succination is a significant PTM and a potential key mechanism linking multiple pathways that may cause dysregulation of cell metabolism in prokaryotes. Proyecto de Graduación (Bachillerato en Ingeniería en Biotecnológia) Instituto Tecnológico de Costa Rica, Escuela de Biología, 2022 Fri, 01 Apr 2022 00:00:00 GMT https://hdl.handle.net/2238/13916 2022-04-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/2238/12434 Establishment and characterization of a brain cell culture model system of myotonic dystrophy type 1 Vaglio-Garro, Annette Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is an autosomal dominant genetic disease caused by the expansion of an unstable CTG repeat in the 3’UTR of the dystrophia myotonica-protein kinase (DMPK) gene. DM1 is the most common form of adult muscular dystrophy. It was initially considered as a muscle disease, but today it is known that DM1 is a multisystemic disease that affects many tissues and organs, including the central nervous system (CNS). Indeed, DM1 patients present debilitating neurological manifestations, such as hypersomnia, cognitive and learning impairment. Congenital DM1 shows severe mental retardation. The unsteady CTG sequence in DM1 tends to expand in size when it is transmitted vertically from one generation to the next. Intergenerational trinucleotide repeat instability serves as the molecular explanation of the phenomenon of anticipation, meaning the increasing severity and decreasing age of onset in successive generations of a DM1 families The repeat is also unstable in somatic tissues, continuing to expand throughout the patient´s life. Important symptoms of DM1 are explained by the nuclear accumulation of toxic, expanded DMPK transcripts and subsequent deregulation of RNA-binding proteins, which leads to missplicing in multiple tissues, including brain. However, the molecular pathways contributing to DM1 neuropsychological dysfunction are still unknown. To investigate the disease pathogenesis, DMSXL transgenic mice, carrying large CTG expansions (>1000 repeats) within the human DM1 locus, were generated and studied. In the CNS, these animals show RNA missplicing, as well as Tau hyperphosphorylation, recreating, to a certain extent, the spliceopathy and tauopathy described in humans. A global proteomic approach and the study of candidate genes on DMSXL brains revealed molecular abnormalities in proteins involved in the regulation of calcium metabolism. These findings suggest that the DM1 CTG expansions may affect calcium homeostasis in the CNS. To validate this hypothesis, neuroblastoma and astroglioma cell lines have were transfected with a large CTG repeat expansion. These cell model systems recreate important features of the DM1 molecular pathology, such as toxic RNA accumulation in the nuclei, missplicing of critical candidate genes. Nevertheless, no obvious splicing abnormalities were detected in the list of genes involved in calcium metabolism, selected for this study. In contrast to the findings reported in skeletal muscle and heart of DM1 patients, CELF1 expression was not significantly changed by the CTG expansion in cultured brain cells. In conclusion, the presence of foci and missplicing of some candidate genes validates our brain model system of DM1-associated RNA toxicity. However, the system may require further studies and refinement to perform functional analysis of calcium metabolism and flux at later stages.; La Distrofia Miotónica tipo 1 (DM1) es una enfermedad genética autosómica dominante causada por la expansión inestable de las repeticiones CTG en la región 3’UTR del gen de la distrofia miotónica de una proteína kinasa (DMPK). DM1 es la forma adulta más común de distrofia muscular. Inicialmente fue considerada como una enfermedad muscular, hoy en día se sabe que DM1 es una enfermedad multisistémica que afecta a varios tejidos y órganos, incluyendo el sistema nervioso central (SNC). En efecto, los pacientes con DM1 presentan debilitamiento neurológico, así como hipersomnolencia, discapacidades cognitivas y de aprendizaje. La forma congénita de DM1 muestra retardo mental severo. La poca estabilidad de la secuencia CTG en DM1 tiende a expandirse en tamaño cuando se transmite de manera vertical de una generación a la siguiente. El desequilibrio de las repeticiones trinucleótidas intergeneracionales sirve como explicación molecular del fenómeno de anticipación, indicando un aumento en la severidad y una disminución en la edad de inicio en generaciones sucesivas de una familia con DM1. La repetición también es inestable en tejidos somáticos, expandiéndose a través de la vida del paciente. Algunos síntomas importantes de DM1 son explicados por la acumulación nuclear de toxinas, transcritos extendidos de DMPK y subsecuentemente la desregulación de ARNs que unen proteínas, lo cual origina el editaje incorrecto en múltiples tejidos, incluyendo el cerebro. Por otro lado el mecanismo molecular que contribuye a la neurodisfunción sicológica en DM1 sigue siendo desconocido. Para investigar la patogénesis de la enfermedad, se creó y estudio el ratón transgénico DMSXL, que contiene largas expansiones de CTG (>1000 repeticiones) de humanos. En el SNC, estas anormalidades muestran missplicing del ARN, así como la hiperfosforilación de Tau, recreando la spliceopatía y taupatía descrita en humanos. Un enfoque global proteómico y el estudio de genes candidatos en muestras de cerebro del ratón DMSXL revela anormalidades moleculares en proteínas involucradas en la regulación del metabolismo del calcio. Estos descubrimientos sugieren que las expansiones de la repetición CTG en DM1 pueden afectar la homeostasis de calcio en el SNC. Para validar esta hipótesis, líneas celulares de neuroblastoma y astroglioma fueron transfectadas con expansiones de las repeticiones de CTG. Este modelo celular recrea importantes características de la patología molecular de DM1, como la acumulación de ARN tóxico en el núcleo y el missplicing en genes candidatos críticos. Sin embargo, no se detectó anormalidades en el proceso de corte y empalme para la lista de genes candidatos analizados y relacionados al metabolismo del calcio en este estudio. En contraste con lo reportado en estudios previos de muestras musculares y cardiacas de pacientes con DM, los cambios en la expresión de CELF1 no fueron significativos en las células cerebrales que contenían la expansión de CTG. En conclusión, la presencia de foci y missplicing en algunos genes candidatos valida este sistema modelo de células cerebrales como útil para estudiar la enfermedad DM1 asociado a la toxicidad del ARN. Por otro lado, el sistema requiere otros estudios y el desarrollo refinado de análisis funcionales del metabolismo y flujo de calcio en etapas posteriores. Proyecto de Graduación (Bachillerato en Ingeniería en Biotecnología) Instituto Tecnológico de Costa Rica, Escuela de Biología, 2011 Sat, 01 Jan 2011 00:00:00 GMT https://hdl.handle.net/2238/12434 2011-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/2238/11480 Diseño de un alimento funcional a base de un extracto de manzana (Malus Domestica Variedad Anna) con potencial antioxidante Gómez-González, Julio César Actualmente existe gran demanda comercial de productos alimenticios preparados con ingredientes naturales, especialmente, aquellos que incluyen componentes con potencial bioactivo. Para este estudio, se utilizó un extracto de manzana con potencial antioxidante para la preparación de un alimento funcional, en presentación de “gomitas”. En pruebas preliminares se realizaron extracciones hidroalcohólicas por maceración de manzana (Malus domestica), donde se obtuvo numéricamente mayor concentración de polifenoles totales en muestras desecadas por liofilización al vacío que deshidratadas en un desecador. En una segunda etapa se compararon grados de maduración de manzanas variedad Anna y el porcentaje de etanol como solvente en la extracción de polifenoles totales, así como la capacidad antioxidante de los extractos para reducir el DPPH. Se obtuvo poca diferencia entre tratamientos, pero se eligió realizar posteriores extracciones con etanol al 70% de muestras de manzana pintonas, porque los polifenoles tienden a disminuir conforme avanza la maduración. Se hicieron tres repeticiones de extracciones de esta manera y no se obtuvo diferencia significativa entre ellas, generando 3252,97±98,80 mg EAG/L en promedio. Los extractos analizados tanto de muestras maduras como pintonas resultaron positivos para la presencia de flavonoides y leucoantocianidinas. Se realizaron pruebas de elaboración de un alimento funcional tipo gomita con estos extractos utilizando fibra de alga agar deshidratada y gelatina pura como gelificantes. Sin embargo, la vida útil de este producto fue menor a 48 horas a temperatura ambiente sin preservantes. Estos datos sugieren que la manzana variedad Anna puede ser utilizada como materia prima biofuncional con potencial antioxidante, pero se debe optimizar el vehículo de administración.; Nowadays, it exists a great commercial demand of food products prepared with natural ingredients, especially, which included bioactive potential components. In this study, it was used an apple extract with antioxidant potential for preparing a gummy functional food. At initial probes, apple (Malus domestica) hydroalcoholic extracts were done by mean of maceration, which had little difference between solvents and a bigger total polyphenols concentration with vacuum-freeze-dried samples than dehydrated in a dehydrator. At a second stage, different apples var. Anna maduration grades were compared and ethanol percentage of the solvent for the polyphenols content extraction, and extracts antioxidant ability for reducing DPPH. It was obtained little difference between treatments, but it was chosen 70% ethanol and not yet completely mature apples at further extractions, because polyphenols tend to reduce along maduration. Were done three repetitions of extractions in this way and it was not obtained significant difference between them, but with a mean of 3252,97±98,80 mg GAE/L and a IC50 of 0,261μL. Analyzed extracts of mature and not yet completely mature samples resulted positive for the flavonoids and leucoantocianidines presence. Gummy functional food probes were done with these extracts using dehydrated agar algae fiber and pure gelatine as gelificants however, product useful life was less than 48 hours at ambient temperature. Data suggest apple var. Anna can be utilized as biofunctional raw material with antioxidant potential, but it is necessary to optimize the administration vehicle. Proyecto de Graduación (Licenciatura en Ingeniería en Biotecnología) Instituto Tecnológico de Costa Rica, Escuela de Biología, 2019 Tue, 01 Jan 2019 00:00:00 GMT https://hdl.handle.net/2238/11480 2019-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/2238/11448 Evaluación de espectros Raman del ADN genómico y perfil proteico de dos bacterias de importancia biomédica mediante la metodología SERS Solís-Campos, Esteban Anualmente, alrededor de 420 000 personas mueren a nivel mundial por consumir alimentos contaminados, lo cual repercute en la necesidad de desarrollar métodos de detección de microorganismos patógenos que sean rápidos, reproducibles y baratos. La espectroscopía Raman destaca como una técnica capaz de cumplir con estas características, por lo cual esta investigación buscó obtener espectros Raman del ADN genómico y proteínas de Salmonella enterica y Klebsiella pneumoniae, bacterias relacionadas con intoxicaciones por alimentos y propagación de enfermedades nosocomiales, respectivamente. Se utilizó la metodología SERS, donde se monitorearon dos agentes reductores (NaBH4 y citrato) y un estabilizante (citrato) para la síntesis de AgNPs. Alternativamente, se optimizó la extracción del ADN genómico y se realizaron diluciones hasta 1:64, las cuales fueron sometidas a SERS. Para el análisis de proteínas totales, se probaron los métodos de extracción con fenol saturado y TRIzol; y se evaluaron los extractos del mejor por medio de SERS. De esta manera, se eligió la síntesis de AgNPs reducidas con NaBH4 y estabilizadas con citrato, bajo la proporción molar 1:4:0,1 (AgNO3:NaBH4:citrato); con partículas esféricas de 65 nm de diámetro y λmáx en 387-391 nm. El ADN evidenció las señales típicas de las bases nitrogenadas, fosfato y desoxirribosa en SERS, cuyas concentraciones óptimas en la detección estuvieron entre los 34,4 ng/μL y 235,1 ng/μL. En cuanto a la extracción de proteínas, se seleccionó la extracción fenólica por evidenciar una pureza significativamente mayor (p>0,05). Se pudieron caracterizar más de diez señales características de los modos vibracionales de las proteínas por medio de SERS, a pesar de las bajas intensidades obtenidas. Proyecto de Graduación (Bachillerato en Ingeniería en Biotecnología) Instituto Tecnológico de Costa Rica, Escuela de Biología, 2017 Sun, 01 Jan 2017 00:00:00 GMT https://hdl.handle.net/2238/11448 2017-01-01T00:00:00Z