Inducción de variabilidad genética en una variedad comercial de arroz (Oryza sativa) mediante el uso de radiación gama a partir de la selección in vitro de mutantes tolerantes a ariloxifenoxipropionatos para su uso en el fitomejoramiento del cultivo - Hernández-Soto, Alejandro (Instituto Tecnológico de Costa Rica, 2023)
El principio de mejoramiento genético basado en mutaciones consiste en generar cambios hereditarios en el ADN mediante agentes externos. La mutagénesis inducida mediante radiación gamma ofrece una alternativa para desarrollar líneas de arroz resistentes al estrés biótico y abiótico al acelerar el proceso de mutación espontánea y aumentar el conjunto de variantes alélicas disponibles para la mejora genética. En el presente trabajo se exploran las bases técnicas para lograr la mutagénesis in vitro mediante radiación gamma (60Co) con el rasgo de tolerancia al ariloxifenoxipropionato Fluazifop-P-Butil como modelo para crear variabilidad en una variedad local de arroz Lazarroz FL. El primer parámetro estandarizado que se logró fue la radiosensibilidad de los callos embriogénicos. La dosis letal 30 se calculó a partir de 1680 callos con exposición de gradiente de 0-120 Gy en 81,8 Gy (77,507-86,403). El segundo parámetro fue la sensibilidad a los ariloxifenoxipropionatos como agente de selección. La dosis letal media fue de 6,93 mg / L (0,425 mg / L - 15,743 mg / L, R2 = 0,402, 1000n) para callos y la dosis letal media de 3.771mg / L (R2 = 1, 290n) para plantas in vitro. La secuenciación del gen diana ACCasa2 y las secuencias de control matK, rbcL con el pre-identificador NCBI MZ558337, MZ558334, MZ558335, demostraron que la variedad comercial utilizada tiene ausencia de mutaciones. El sistema se ejecutó con 60Gy en callo embriogénico, regeneración, preselección a 5mg/L y selección final a 5mg/L de Fluazifop-P-Butil. Lo anterior resultó en un único mutante putativo tolerante a partir de 8000 vitroplantas regeneradas. La línea tolerante presentó una tasa de mutación aproximada de 1/1000pb en el gen blanco ACC2 (T2222I/T2222M) y en los controles matK, rbcL. Es posible que la mutación en el gen blanco ACC2 esté vinculada a la tolerancia, sin embargo, no se puede descartar otros mecanismos no evaluados. El trabajo exploró el uso de semilla como tejido de partida para la radiación in vitro, lo que permitió una exposición de 50- 350Gy, y un incremento en el número de mutantes putativos de 31. Un método alterno para generar mutaciones con mayor precisión es mediante CRISPR-Cas9, el proyecto exploró la técnica en levaduras de un gen homólogo de arroz como modelo para proveer tolerancia a salinidad. Se logró una mutación en el gen NTH2, nth2 1271_1272delTA, lo que incrementó la tolerancia de la levadura al estrés salino con capacidad de crecimiento a 0.8M NaCl a una tasa de 0.2179 ± 0.0061 h−1 en comparación con la silvestre de 0.1580 ± 0.0009 h−1.

The mutation breeding principle is to generate heritable changes in the DNA by external agents. Induced mutagenesis by gamma rays offers a promising alternative for developing rice varieties resistant to biotic and abiotic stresses. It could accelerate the spontaneous mutation process and increase the pool of allelic variants available for genetic improvement. Here we present the technical bases to achieve in vitro Gamma radiation (60Co) mutagenesis with Fluazifop P-Butyl tolerant trait as a model to create rice variability in a local variety used by farmers, Lazarroz FL. The first standardized parameter achieved was the radiosensitivity of embryogenic calli. The dose was 81.8Gy (77.507-86.403) for LD30, obtained from 1680 callus tested on a 0-120Gy gradient. The second parameter was the sensibility to the aryloxyphenoxypropionates as a selection agent. The dose was 6.93mg/L (0.425 mg/L- 15.743 mg/L, R2= 0.402, 1000 callus) for callus LD50, and 3.771mg/L (R2= 1, 290n) LD50 for Vitro plants. Target gene sequencing ACCasa2, and control sequences matK, rbcL summited to the NCBI id MZ558337, MZ558334, MZ558335, demonstrated that the commercial variety used had an absence of mutations. The mutation system was done at 60Gy on embryogenic calli, regeneration, preselection on 5mg/L and final selection on 10mg/L Fluazyfop P-Butyl resulting in 1/8000 putative tolerant vitro plant. The tolerant line had a mutation rate of approximately 1/1000bp in the control genes matK, rbcL as well as the target gene ACC2 (T2222I/T2222M). The mutation may be linked to the tolerance; however, it could also be the result of other non-evaluated detoxification mechanism. The in vitro system was improved by using seeds as a starting point for irradiation, allowing an exposition window of 50- 350Gy and 31 putative mutants. An alternative method to generate precise mutations is CRISPR CAS9. The project explored the technique in a yeast gene homologous to rice as a model to provide salt tolerance. We achieved a mutation on gene NTH2, nth2 1271_1272delTA, resulting in increased salt tolerance of the yeast capable of better growing under 0.8M NaCl at a rate of 0.2179 ± 0.0061 h−1 versus wild type 0.1580 ± 0.0009 h−1.
Tesis (Doctorado en Ciencias Naturales para el Desarrollo con énfasis en Sistemas de Producción Agrícola) Instituto Tecnológico de Costa Rica. Universidad Nacional de Costa Rica. Universidad Estatal a Distancia de Costa Rica, Doctorado en Ciencias Naturales para el Desarrollo, 2023.
Keywords: Mejoramiento genético - Arroz; Mutación inducida; Mutagénesis - Radiación gamma; Cultivo in vitro; Tolerancia - Levadura - Estrés salino; CRISPR-Cas9