Implementation of NMR and macromolecular crystallography techniques for structural characterization of proteins of biomedical interest - (:unkn) unknown (Editorial Tecnológica de Costa Rica (entidad editora), 2026)
Implementación de las técnicas de RMN y cristalografía de macromoléculas para la caracterización estructural de proteínas de interés biomédico
The implementation of cutting-edge biophysics techniques to analyze proteins at atomic-scale, such as nuclear magnetic resonance (NMR) and X-ray crystallography, allows the study of molecular interaction ́s mechanisms between proteins of interest and, -in some cases-, allows exploring alternative mechanisms for new drug design. Our research group has developed two lines of research seeking to implement and consolidate the biophysical techniques mentioned above, with the aim of better understanding the interactions between substrates, such as factor VIII and platelet receptor PAR1, with thrombin, in the processes of blood coagulation; and on the other hand, to better understand the functional activity of some proteins from snake venoms. The interaction between connectors of the human FVIII with thrombin was studied through NMR mono-, bi- and tri-dimensional assays. For these experiments, the human FVIII connectors were labelled with 1H, 13C and 15N isotopes using heterologous overexpression in Escherichia coli strains. Through X-ray crystallography technique, crystals of complexes between recombinant proteins and thrombin have been grown, and a series of FVIII and PAR1 mutants have been developed to favor more stable intermediate complexes with thrombin. On the other hand, a metalloproteinase from the snake venom of Crotalus simus and a phospholipase from Botriechis schelegelii have also been analyzed. From the latter, a 3D structure was obtained at a high resolution (~2.5 Å).
La implementación de novedosas técnicas biofísicas para análisis de proteínas a escala atómica, tales como la resonancia magnética nuclear de proteínas (RMN) y la cristalografía de rayos X, permiten el estudio de los mecanismos moleculares de interacción entre proteínas de interés y, -en algunos casos-, permite explorar mecanismos alternativos para el diseño de nuevos fármacos. Nuestro grupo ha desarrollado dos líneas de investigación buscando implementar y consolidar dichas técnicas biofísicas, con el objetivo de comprender mejor las interacciones entre sustratos, -como el factor VIII y el receptor de plaquetas PAR1- con la trombina, en los procesos de coagulación sanguínea; y, por otra parte, conocer mejor la actividad funcional de algunas proteínas provenientes de venenos de serpientes. La interacción de regiones conectoras del FVIII humano con la trombina fue estudiada utilizando la técnica de RMN, a través de ensayos mono, bi y tri-dimensionales, donde los conectores del FVIII humano fueron marcados con los isótopos 1H, 13C y 15N empleando sobreexpresión heteróloga en cepas de Escherichia coli. Mediante la técnica de cristalografía de rayos X se ha logrado obtener cristales a partir de la generación de complejos de las proteínas recombinantes humanas con la trombina, y se han desarrollado una serie de mutantes del FVIII y PAR1, para favorecer complejos intermediaros más estables con la trombina. Por último, se ha trabajado con una metaloproteinasa del veneno de la serpiente Crotalus simus y una fosfolipasa de Botriechis schelegelii. De esta última se obtuvo una estructura 3D a una alta resolución (~2.5 Å).
Keywords: Macromolecules; NMR; crystallization; X-ray diffraction; crystallography; protein 3D structure; FVIII; thrombin; phospholipases; metalloproteases; Macromoléculas; RMN; cristalización; difracción de rayos X; cristalografía; estructura 3D de proteínas; FVIII; trombina; fosfolipasas; metaloproteasas