Desarrollo de una nueva metodología de transformación genética no tradicional, como estrategia potencial para incluir resistencia a infecciones fúngicas en vainilla (Vainilla Planifolia). - Gätjens-Boniche, Omar; Montero-Carmona, Wayner (Instituto Tecnológico de Costa Rica., 2012)
Este estudio consistió en la evaluación de las condiciones experimentales para laransformación genética de Vanilla planifolia por medio de un sistema de biobalística de baja presión. Los meristemos radicales de aproximadamente 0.5 cm, provenientes de microestacas desarrolladas en un medio líquido MS básico en agitación, se colocaron en un medio osmótico 16 hr antes y 24 hr después del bombardeo, posteriormente se subcultivaron en medio MS suplementado con 1 y 3 mg/L de benciladenina. Se incluyeron controles de bombardeo sin plásmido y controles de explantes, con y sin estrés osmótico. 48 hr después del bombardeo se realizó la prueba de expresión transitoria con el X-Gluc y se observó una tinción azulada en la epidermis de las terminales radicales bombardeadas con el plásmido así como también en los controles. A las 2 semanas también se presentó tinción en las regiones externa e interna de las estructuras iniciales que conducen a la formación de los PLBs en todos los tratamientos evaluados y los controles. La presencia de la tinción azul correspondiente a la degradación del sustrato X-Gluc en los controles, evidencia la expresión de enzimas endógenas en los tejidos de la planta que podrían interferir con la interpretación de los resultados de expresión transitoria. Este sería el primer reporte de actividad -glucoronidasa endógena en materiales in vitro de vainilla. De acuerdo a la evidencia obtenida, el estrés inducido por el choque osmótico en las terminales radicales de vainilla, puede provocar contaminación por un aumento en el crecimiento de potenciales microorganismos endógenos y por ende, la pérdida de material vegetal. Aunque es factible utilizar meristemos radicales de vainilla para la transformación genética de esta especie, se propone que una estructura más apropiada para este fin podría ser el estadio inicial observado cuando se forma el PLB a partir de los meristemos radicales. _______________________________________________________________________ Abstract: This study consisted in the evaluation of the experimental conditions for genetic transformation of Vanilla planifolia by a biolistic system under low pressure. Root tips of 0.5 cm of length, from seedlings developed in basic MS liquid medium under agitation, were placed in an osmotic medium, 16 hr before and 24 hr after bombarding, subsequently they were placed in MS culture medium supplemented with 1 and 3 mg/L benzyladenine. The assay included bombarding controls without plasmid and controls of explants with and without osmotic stress. After 48 hr of bombarding, root tips were exposed to X-Gluc and a blue staining was observed in the epidermis of the root tips, as well as in the controls. After 2 weeks, the blue staining was also present in the external and internal areas of the initial structures that become PLBs, in all the treatments evaluated and controls. The presence of the staining corresponding to X-Gluc substrate degradation in the controls evidences the expression of endogenous enzymes in plant tissue, which could interfere with interpretation of transient expression results. This would be the first report of endogenous -glucuronidase activity in in vitro vanilla materials. According to the obtained evidence, it is also important to take into consideration that stress induced by osmotic shock in the terminal tips of vanilla plants, could cause contamination by an increase in the growth of potential endogenous microorganisms and, consequently the loss of plant material. Although it is possible to utilize vanilla root meristems for genetic transformation of this species, it is postulated that a more appropriated structure for transformation could be the initial stage on the process of PLB formation from root meristems.
Proyecto de Investigación (Código: 5402-2160-2701) Instituto Tecnológico de Costa Rica. Vicerrectoría de Investigación y Extensión (VIE). Escuela de Ciencias y Letras, 2012
Keywords: Vanilla planifolia; Terminales radicales; Transformación genética; β-glucoronidasa; PLBs; Root tips; Genetic transformation