Desarrollo de una metodología de propagación, producción de raíces y formación de callos protocórmicos a partir de meristemos radicales de vainilla (Vanilla planifolia)

Abstract

Existen problemas asociados al cultivo de la vainilla, como los relacionados al control de las plagas y enfermedades, tales como la pudrición de raíces generado por el hongo Fusarium sp. Por tal razón, el perfeccionamiento de la biotecnología permite desarrollar metodologías de transformación genética no tradicional que podrían ser usadas como técnicas alternativas para el mejoramiento genético de la vainilla, los cuales pueden brindar resistencia a plagas y enfermedades, como también de mejorar aspectos agronómicos de producción. El objetivo general de esta investigación fue de desarrollar un sistema de propagación, producción de raíces y formación de callos protocórmicos a partir de meristemos radicales como base para la transformación genética de vainilla (Vanilla planifolia). Además, se determinaron los componentes y condiciones físicas del medio de cultivo para la formación de “pre-callos” y callos protocórmicos, para efecto de este trabajo de investigación se define un “pre-callo” como la formación de un abultamiento que se generó a partir de los meristémos radicales de vainilla como una estructura transitoria, ya que al modificar sus condiciones de crecimiento pueden generar dos vías, como PLB’s o como callos protocórmicos. También se determinó el fenotipo apropiado del callo protocórmico de vainilla, que será utilizado como material biológico para realizar la transformación genética de esta especie. La micropropagación in vitro de vainilla se realizó en un medio de cultivo MS líquido suplementado con 1mg/L de BAP en oscuridad, este se subcultivo en tres ocasiones y para el cuarto subcultivo se baso en un medio de cultivo MS líquido sin reguladores de crecimiento en oscuridad para generar la producción de raíces. Se determinó que durante la micropropagación de la vainilla se produjo en promedio 4,78 brotes/explante durante el segundo subcultivo en un medio de cultivo MS líquido suplementado con 1 mg/L de BAP en oscuridad y para la producción de raíces se produjo 4,47 raíces/explante en un medio de cultivo MS líquido sin reguladores de crecimiento suplementado con 1 g/L de CH en oscuridad. Al colocar brotes de estos subcultivos a un medio sólido MS sin reguladores y con 1 g/L de caseína hidrolizada en luz, se reduce a la mitad el tiempo de obtención de plantas para aclimatar (seis semanas) con una altura de 10 cm aproximadamente, con un grosor de 0,41 cm en promedio y entre 3 y 4 hojas con raíces bien formadas. Para la inducción de los “pre-callos” y callos protocórmicos de vainilla, se trabajó con explantes de secciones terminales de raíces de aproximadamente 5 mm de longitud, provenientes de un sistema de propagación en medio líquido en oscuridad, para las cuales se realizaron pruebas con diferentes reguladores de crecimiento BAP (1 mg/L) y 2,4-D (0,5 mg/L, 1 mg/L, 1,5 mg/L y 3 mg/L) y en presencia de luz y oscuridad. Para la formación de “pre-callos” se determinó que hay una gran variedad de tipos de estructuras, se utilizó como material de partida para los callos protocórmicos el “pre-callo tipo 9” el cuál creció en un medio de cultivo MS líquido suplementado con 1 mg/L de BAP y 1 g/L de CH en oscuridad, por ser una estructura muy homogénea e indiferenciada con un 90% de formación. El medio de cultivo que permitió desarrollar el callo protocórmico ideal y en mayor x cantidad (72% de formación) se generó con el pretratamiento de 4 semanas en medio líquido MS suplementado con 1 mg/L de BAP y 1 g/L de CH, los cuales posteriormente se subcultivaron en medio MS sólido con 0,5 mg/L de 2,4-D en oscuridad hasta un periodo de 16 semanas de crecimiento.