A classical strategy to analyse the protein content of a biological sample is the two-dimensional gel electrophoresis (2D-GE). This technique separates proteins by both isoelectric point and molecular weight, and images are taken for subsequent analyses. However, analyses of 2D-GE images require standardized image analysis due to susceptibility of gels to get deformed, presence of overlapping spots and stripes, fuzzy and unstained spots, and others. This represent a difficulty for final users (researchers), which demand for free and user-friendly solutions. We have previously reported the standardization of a protocol to analyse 2D-GE images, and in the current study we applied it to two new bacterial isolates Pseudomonas aeruginosa C25 and C50. We first extracted periplasmic proteins after exposure to antibiotics, and we then run a 2D-GE analysis. Images were analysed using our standardized protocol, achieving the identification of protein spots using CellProfiler after pre-processing step. Comparison between strains was done using differential spot analysis, revealing a specific pattern in the protein expression between bacteria. These results will help to study the biological meaning of these strains using proteomic profiling under different conditions.Una estrategia clásica para analizar el contenido de proteínas de una muestra biológica es la electroforesis bidimensional en gel (2D-GE). Esta técnica separa las proteínas tanto por punto isoeléctrico como por peso molecular, y se toman imágenes para análisis posteriores. Sin embargo, los análisis de imágenes 2D-GE requieren un análisis de imagen estandarizado debido a la susceptibilidad de los geles a deformarse, la presencia de manchas y rayas superpuestas, manchas borrosas y sin teñir, y otros. Esto representa una dificultad para los usuarios finales (investigadores), que demandan soluciones gratuitas y fáciles de usar. Anteriormente informamos de la estandarización de un protocolo para analizar imágenes 2D-GE, y en el estudio actual lo aplicamos a dos nuevos aislados bacterianos Pseudomonas aeruginosa C25 y C50. Primero extrajimos proteínas periplásmicas después de la exposición a antibióticos y luego realizamos un análisis 2D-GE. Las imágenes se analizaron usando nuestro protocolo estandarizado, logrando la identificación de manchas de proteína usando CellProfiler después del paso de preprocesamiento. La comparación entre cepas se realizó mediante análisis de puntos diferenciales, que reveló un patrón específico en la expresión de proteínas entre bacterias. Estos resultados ayudarán a estudiar el significado biológico de estas cepas utilizando perfiles proteómicos en diferentes condiciones.