Listeria monocytogenes is an opportunistic intracellular pathogen that has become one of the most important causes of foodborne infections worldwide. Due to the importance of L. monocytogenes in public health many protocols for the identification and typing of this organism have been described, but for the most part they are very complex and long lasting. For this reason, a multiplex PCR was developed for the rapid and sensitive detection of this bacterium in different types of samples. The objective of the present study was to optimize the multiplex PCR technique for the identification of L. monocytogenes. Different annealing temperatures were tested to determine which has the highest specificity, avoiding nonspecific amplifications. Amplifications were obtained at 57 ° C and lower temperatures. It is concluded that the best temperature for tm is 57 ° C.Listeria monocytogenes es un patógeno intracelular oportunista que se ha convertido en una de las causas más importante de infecciones transmitidas por alimentos en todo el mundo. Debido a la importancia de L. monocytogenes en la salud pública se han descrito muchos protocolos para la identificación y tipificación de este organismo, pero en su mayoría son muy complejos y de larga duración. Por esta razón, se desarrolló un PCR multiplex, para la detección rápida y sensible de esta bacteria en diferentes tipos de muestras. El objetivo del presente estudio fue optimizar la técnica de PCR multiplex para la identificación de L. monocytogenes. Se probaron distintas temperaturas de anillamiento para determinar cuál presenta mayor especificidad, evitando las amplificaciones inespecíficas. Se obtuvo amplificaciones a 57°C y temperaturas menores. Se concluye que la mejor temperatura para tm es la de 57°C.