Establishment and characterization of a brain cell culture model system of myotonic dystrophy type 1

Abstract

Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is an autosomal dominant genetic disease caused by the expansion of an unstable CTG repeat in the 3’UTR of the dystrophia myotonica-protein kinase (DMPK) gene. DM1 is the most common form of adult muscular dystrophy. It was initially considered as a muscle disease, but today it is known that DM1 is a multisystemic disease that affects many tissues and organs, including the central nervous system (CNS). Indeed, DM1 patients present debilitating neurological manifestations, such as hypersomnia, cognitive and learning impairment. Congenital DM1 shows severe mental retardation. The unsteady CTG sequence in DM1 tends to expand in size when it is transmitted vertically from one generation to the next. Intergenerational trinucleotide repeat instability serves as the molecular explanation of the phenomenon of anticipation, meaning the increasing severity and decreasing age of onset in successive generations of a DM1 families The repeat is also unstable in somatic tissues, continuing to expand throughout the patient´s life. Important symptoms of DM1 are explained by the nuclear accumulation of toxic, expanded DMPK transcripts and subsequent deregulation of RNA-binding proteins, which leads to missplicing in multiple tissues, including brain. However, the molecular pathways contributing to DM1 neuropsychological dysfunction are still unknown. To investigate the disease pathogenesis, DMSXL transgenic mice, carrying large CTG expansions (>1000 repeats) within the human DM1 locus, were generated and studied. In the CNS, these animals show RNA missplicing, as well as Tau hyperphosphorylation, recreating, to a certain extent, the spliceopathy and tauopathy described in humans. A global proteomic approach and the study of candidate genes on DMSXL brains revealed molecular abnormalities in proteins involved in the regulation of calcium metabolism. These findings suggest that the DM1 CTG expansions may affect calcium homeostasis in the CNS. To validate this hypothesis, neuroblastoma and astroglioma cell lines have were transfected with a large CTG repeat expansion. These cell model systems recreate important features of the DM1 molecular pathology, such as toxic RNA accumulation in the nuclei, missplicing of critical candidate genes. Nevertheless, no obvious splicing abnormalities were detected in the list of genes involved in calcium metabolism, selected for this study. In contrast to the findings reported in skeletal muscle and heart of DM1 patients, CELF1 expression was not significantly changed by the CTG expansion in cultured brain cells. In conclusion, the presence of foci and missplicing of some candidate genes validates our brain model system of DM1-associated RNA toxicity. However, the system may require further studies and refinement to perform functional analysis of calcium metabolism and flux at later stages.

La Distrofia Miotónica tipo 1 (DM1) es una enfermedad genética autosómica dominante causada por la expansión inestable de las repeticiones CTG en la región 3’UTR del gen de la distrofia miotónica de una proteína kinasa (DMPK). DM1 es la forma adulta más común de distrofia muscular. Inicialmente fue considerada como una enfermedad muscular, hoy en día se sabe que DM1 es una enfermedad multisistémica que afecta a varios tejidos y órganos, incluyendo el sistema nervioso central (SNC). En efecto, los pacientes con DM1 presentan debilitamiento neurológico, así como hipersomnolencia, discapacidades cognitivas y de aprendizaje. La forma congénita de DM1 muestra retardo mental severo. La poca estabilidad de la secuencia CTG en DM1 tiende a expandirse en tamaño cuando se transmite de manera vertical de una generación a la siguiente. El desequilibrio de las repeticiones trinucleótidas intergeneracionales sirve como explicación molecular del fenómeno de anticipación, indicando un aumento en la severidad y una disminución en la edad de inicio en generaciones sucesivas de una familia con DM1. La repetición también es inestable en tejidos somáticos, expandiéndose a través de la vida del paciente. Algunos síntomas importantes de DM1 son explicados por la acumulación nuclear de toxinas, transcritos extendidos de DMPK y subsecuentemente la desregulación de ARNs que unen proteínas, lo cual origina el editaje incorrecto en múltiples tejidos, incluyendo el cerebro. Por otro lado el mecanismo molecular que contribuye a la neurodisfunción sicológica en DM1 sigue siendo desconocido. Para investigar la patogénesis de la enfermedad, se creó y estudio el ratón transgénico DMSXL, que contiene largas expansiones de CTG (>1000 repeticiones) de humanos. En el SNC, estas anormalidades muestran missplicing del ARN, así como la hiperfosforilación de Tau, recreando la spliceopatía y taupatía descrita en humanos. Un enfoque global proteómico y el estudio de genes candidatos en muestras de cerebro del ratón DMSXL revela anormalidades moleculares en proteínas involucradas en la regulación del metabolismo del calcio. Estos descubrimientos sugieren que las expansiones de la repetición CTG en DM1 pueden afectar la homeostasis de calcio en el SNC. Para validar esta hipótesis, líneas celulares de neuroblastoma y astroglioma fueron transfectadas con expansiones de las repeticiones de CTG. Este modelo celular recrea importantes características de la patología molecular de DM1, como la acumulación de ARN tóxico en el núcleo y el missplicing en genes candidatos críticos. Sin embargo, no se detectó anormalidades en el proceso de corte y empalme para la lista de genes candidatos analizados y relacionados al metabolismo del calcio en este estudio. En contraste con lo reportado en estudios previos de muestras musculares y cardiacas de pacientes con DM, los cambios en la expresión de CELF1 no fueron significativos en las células cerebrales que contenían la expansión de CTG. En conclusión, la presencia de foci y missplicing en algunos genes candidatos valida este sistema modelo de células cerebrales como útil para estudiar la enfermedad DM1 asociado a la toxicidad del ARN. Por otro lado, el sistema requiere otros estudios y el desarrollo refinado de análisis funcionales del metabolismo y flujo de calcio en etapas posteriores.