Identificación de especies de Nematodos Fitopatógenos de los Géneros Globodera spp. y Meloidogyne spp. por medio de dos técnicas moleculares

Abstract

Los nematodos de quiste de la papa (Globodera spp.) y los nematodos formadores de nódulos de la raíz (Meloidogyne spp.) causan graves pérdidas de importancia económica a diferentes cultivos en Costa Rica. G. pallida, G. rostochiensis y algunas especies de Meloidogyne spp. son plagas cuarentenarias, por lo que se encuentran entre los nematodos de mayor regulación en el comercio agrícola. En este trabajo se pretende estandarizar algunas técnicas para el diagnóstico molecular de estos géneros. Se realizaron amplificaciones en reacción múltiple, con imprimadores universales y específicos (ITS5, PITSr3 y PITSp4, para Globodera spp.; JMV1, JMV2, JMVhapla y JMVtropical, para Meloidogyne spp.), amplificaciones con PCR Simple (GpaF/GpaR y GroF/GroR, para Globodera spp.; Blo4/Blo5, para Meloidogyne spp.) y PCR-RFLPs de la región ITS del ADN ribosomal, utilizando las enzimas AluI, MspI, DraI y RsaI. Se lograron identificar las muestras locales de Globodera spp. como G. pallida. En el caso de Meloidogyne spp., se identificaron las especies M. hapla, M. incognita y M. salasi; algunas muestras no pudieron ser identificadas, pero se descartó la posibilidad de que fueran una de las tres especies mencionadas. La reacción múltiple con imprimadores específicos es más apropiada y ventajosa para el diagnóstico molecular en análisis de rutina, ya que permite detectar especies simultáneamente en la misma muestra. La enzima AluI fue la que mostró los mejores resultados para la distinción de especies de Meloidogyne spp. En el caso de Globodera spp., ambas enzimas utilizadas (AluI y MspI) presentaron resultados concluyentes para la diferenciación entre especies. La especie M. salasi fue descrita en Costa Rica en 1984 y hasta el momento no existía confirmación molecular de su estatus de especie, así, esta es la primera vez que datos moleculares apoyan la nominación de M. salasi.

Potato Cyst Nematodes (Globodera spp.) and Root-Knot Nematodes (Meloidogyne spp.) cause severe losses of economic importance in different crops in Costa Rica. G. pallida, G. rostochiensis and some species of Meloidogyne spp. are considered quarantine pests and are among the most regulated nematodes in agriculture. The objective in this paper was to standardize some of the molecular diagnostic techniques for both genera. Multiplex PCR, with species-specific and universal primers (ITS5, PITSr3 & PITSp4, for Globodera spp.; JMV1, JMV2, JMVhapla & JMVtropical, for Meloidogyne spp.), Simple PCR (GpaF/GpaR & GroF/GroR, for Globodera spp.; Blo4/Blo5, for Meloidogyne spp.), and amplified ITS region of ribosomal DNA PCR-RFLPs, using AluI, MspI, DraI and RsaI restriction enzymes, were performed. The local samples of Globodera spp. were identified as G. pallida. In Meloidogyne spp., the species M. hapla, M. incognita and M. salasi were identified; some samples could not be identified, but the possibility of them being one of the mentioned species was discarded. The Multiplex PCR with species-specific primers allows the simultaneous detection of several species in the same sample, making it the most suitable and advantageous technique for routine analysis in molecular diagnostics. The AluI enzyme demonstrated the best results for species distinction of Meloidogyne spp. In Globodera spp., both of the used enzymes (AluI y MspI) presented conclusive results for differentiation between species. M. salasi was described in Costa Rica in 1984, and up until now there wasn’t a molecular confirmation of its species estatus, which makes this the first time molecular data support the nomination of M. salasi