Estandarización de una PCR-RFLP para la determinación genética de tres poliformismos de la enzima paraoxonasa 1(PON1) en niños costarricenses con leucemia linfocítica aguda

Abstract

La leucemia es el cáncer más común que afecta la niñez costarricense. La leuquemogénesis en niños puede ser explicada por la exposición parental a compuestos cancerígenos como los organofosforados, que son metabolizados por la enzima Paraoxonasa 1 (PON1). Esta enzima varía su actividad y expresión según el ambiente y los polimorfismos. Los más relevantes son Q192R, T108C y L55M. El objetivo del estudio fue la estandarización de un protocolo de PCRRFLP, para la determinación genética de tres polimorfismos de la enzima PON1 en un grupo de niños costarricenses, cuyos padres fueron expuestos a plaguicidas. Para esta determinación se contó con 90 muestras de ADN provenientes de epitelio bucal de niños. Se probaron dos métodos de obtención de células bucales: por saliva y por cepillo. Se logró normalizar la PCR y se obtuvo la amplificación de los polimorfismos al disminuir el volumen de reacción de la PCR (25µl) en un 40%, aumentar la concentración del ADN a 100ng y adicionar coadyuvantes a la reacción de PCR. Se logró amplificar el ADN de 33% de las muestras de cepillos y de 88% para muestras de saliva después de 77 PCRs. El único polimorfismo sin resultados para las muestras de ADN de la población diana fue T108C, el cual representa 22% del total de la variación en la actividad enzimática, por lo que se hace importante la mejoría del protocolo de PCR. El método de obtención de las células bucales y la adición de coadyuvantes podría jugar un papel importante en el éxito de la amplificación del polimorfismo.

The Leukemia is the most common cancer in costarrican childhood. Its development in children could be explained by parent exposure to certain agents like organophosphates, metabolized by the enzyme Paraoxonase 1 (PON1). Its expression and activity is modified by the environment and its polymorphisms. The most important are Q192R, T108C and L55M. The work`s objective was a PCR-RFLP protocol standardization, for the genetic determination of the three most common PON1 polymorphisms in a costarrican children`s group, whose parents were exposed to pesticides. There were 90 DNA samples, taken from buccal cells from children. Two sample collection methods were tested: by saliva and by cytobrush. The PCR reaction worked when lowing the PCR reaction volume (25µl) in 40%, increasing DNA concentration to 100ng and adding coadjuvants. 33% of the DNA samples from cytobrush and 88% of DNA from saliva samples could be amplified after 77 PCRs. The T108C polymorphism was the only without positive results using children`s DNA. This one is responsible for 22% of arylesterase activity, related to PON1 expression in blood. The collection method and the coadjuvants in the reaction could play a very important role in the amplification percentage.