Identificación de microorganismos endógenos en cicadélidos y endófitos asociados a la crespera del café en el Valle Central Occidental de Costa Rica.

Abstract

Identificación de microorganismos asociados a Crespera del Café.

Se muestrearon hojas de bandolas intermedias de plantas sintomáticas para la enfermedad “Crespera del Café” e insectos cicadélidos de campo a partir de una finca infectada ubicada en Naranjo de Alajuela del Valle Central Occidental de Costa Rica. Las muestras de plantas se procesaron mediante tres protocolos de aislamientos de endófitos: A: desinfección con NaClO4 al 10 (T1), 15 (T2) y 20% (T3), incubación a 31ºC; B: desinfección con NaClO4 1% 3,5% i.a (T1) y NaClO4 100% 1,0% i.a (T2) incubándose a 24ºC y C: desinfección con NaClO4 1% y extracción con buffer PBS en dilución concentrada (T1), 10-1 (T2) y 10-2 (T3) incubación a 26ºC. Los insectos se procesaron bajo un protocolo D: desinfección con Cloruro de Benzalconio al 2% de cabezas maceradas en 300ųl del buffer PBS 1X (T1) y cuerpos sin disección en 600ųl del buffer (T2)incubándose a 26ºC. Se inocularon todos los aislamientos en medio BCYE. Las bacterias se identificaron mediante el sistema BIOLOG, DAS-ELISA y validación de algunas muestras para detección de Xylella fastidiosa mediante PCR utilizando los primers 272-1 y 272-2; los aislamientos fúngicos se identificaron mediante la presencia de estructuras de reproducción. El protocolo C mostró ser el más apto para la obtención de endófitos y el D permitió obtener alta diversidad en los aislamientos. Se obtuvieron 21 aislamientos bacterianos siendo el más abundante Serratia marcenses seguido de Raoultella terrigena, Xylella fastidiosa y Enterobacter sp; 13 aislamientos fúngicos incluyendo los géneros Aspergillus, Cladosporium, Paecilomyces, Beauberia y Pythium. La temperatura de 28ºC, y la incubación en oscuridad en medio BCYE por los 22 días permitió aislar Xylella fastidiosa. No hay certeza que los resultados obtenidos en la prueba serológica DAS-ELISA correspondieron a deficiencias de sensibilidad de la misma salvo un aislamiento (Serratia marcenses).

Evaluación de la patogenicidad de los aislamientos.

Se aplicaron pruebas en disco de hoja, tronco de café y con segmentos de pellets sobre láminas enteras para medir la patogenicidad cualitativa de los aislamientos inoculando soluciones de 2.0X107 UFC/ml homogenizadas. La acumulación de cristales foliares ante la presencia de Geobacillus spp y Staphylococcus cohnii, y la proliferación de Pythium spp en las hojas, permitió discriminar su patogenicidad cualitativa.

Bioensayos de microorganismos seleccionados para su correspondencia con la sintomatología de Crespera del Café.

El cicadélido C07 (más abundantes en campo) mostró ser un vector eficiente para la transmisión de Xylella fastidiosa. Generalmente las poblaciones más abundantes de cicadélidos colectados presentaron las concentraciones más altas de Xylella fastidiosa. El método de inoculación en pecíolos mostró mayor eficiencia (96.7%) para incorporar a Xylella fastidiosa que el método de puntura en entrenudo (66.7%). El periodo de observación de posibles síntomas de Crespera en los bioensayos con Xylella fastidiosa, Geobacillus spp y Pseudomonas fluorescens se consideró insuficiente. Se realizaron ensayos de infección con cicadélidos de campo sobre plantas de invernadero en condiciones de 23ºC y 70% de humedad relativa por 15 días y se corroboró la incidencia del patógeno en los insectos luego del ensayo, así como la infección de Xylella fastidiosa mediante DAS-ELISA luego de 3 meses en las hojas jóvenes y maduras. Se emplearon dos métodos de infección mecánica para Xylella fastidiosa, Geobacillus sp y Pseudomonas fluorescens buscando reproducir los síntomas de Crespera. Se corroboró mediante DAS-ELISA la infección de Xylella fastidiosa luego de 3 meses de ensayo en hojas inoculadas y no inoculadas. En ambos ensayos de infección se utilizaron plantas de invernadero de dos meses de edad libres de Xylella fastidiosa. Se buscó relacionar los microorganismos endógenos en cicadélidos con los endófitos en plantas de café y la sintomatología de Crespera.

Identification of Coffee Leaf Scorch associated microorganism.

Leaves from medium branches of symptomatic “Coffee Leaf Scorch” (CLS) plants and cicadelids vector were collected from a cultivated ground area in Naranjo, Alajuela, Occidental Central Valley of Costa Rica. Three different endophytes isolation protocols were performed for plant samples. A: 10 (T1), 15 (T2) and 20% (T3) NaClO4 3,5% a.i disinfection, 31ºC incubation; B: 1% NaClO4 3,5% a.i (T1) and 100% NaClO4 1,0% a.i (T2) disinfection, 24ºC incubation and C: NaClO4 1% 3,5% a.i disinfection and PBS buffer extraction in concentrate solution (T1), 10-1 (T2) and 10-2 (T3) dilution, 26ºC incubation. Protocol D was performed to ground cicadelids endogens microorganism isolation: 2% Quaternary ammonium disinfection for mashed cicadelid’s head in 300ųl PBS1X buffer (T1) and non dissected bodies mashed in 600ųl PBS1X buffer (T2), 26ºC incubation. All isolations were inoculated in BCYE culture medium. BIOLOG® system, DAS-ELISA for Xylella fastidiosa detection and PCR amplification of 272-1 and 272-2 primers validation of some isolation were performed to bacteria’s identification. Fungi identity was determinate with reproduction structure guides. Protocol C showed the best conditions to isolated endophytes, protocol D showed the highest isolation diversity, 21 bacteria isolation were obtained, Serratia marcenses followed by Raoultella terrigena, Xylella fastidiosa and Enterobacter sp were the most frequent. Fungi reported 13 isolations including Aspergillus, Cladosporium, Paecilomyces, Beauberia and Pythium genres. Darkness incubation in BCYE medium within 28ºC was appropriated to Xylella fastidiosa grow after 22 days. There wasn’t certainly evidence that DAS-ELISA’s result represent sensitivity deficiencies. Except for Serratia marcenses isolation, there wasn’t plants microorganism correspondence with insects ones.

Pathogenic conditions of microorganism’s isolations.

Test of all microorganisms over leaves disc, branches segments and pellets pieces were performed to determine pathogenic qualitative condition of 2.0X107 CFU/ml homogenized microorganism solution. Crystal accumulation in foliar superficies in Geobacillus spp and Staphylococcus cohnii pathogenic test and Pythium spp mycelia proliferation allowed their qualitative pathogenic determination.

Bioassays of selected microorganisms for Coffee Leaf Scorch symptoms correspondence.

Vector infection test of cicadelids eating seedling innocuous plants to Xylella fastidiosa were developed into laboratory condition (23ºC and 70% humidity) during 15 days. Xylella fastidiosa infection into cicadelids was corroborated with DAS-ELISA after assay time, mature and early leaves were analyzed for infection three month later. Two methods for mechanic infection of Xylella fastidiosa, Geobacillus sp and Pseudomonas fluorescens were applied to CLS symptoms induction. Inoculated and early leaves were analyzed for effective Xylella fastidiosa infection three month later by DAS-ELISA test. Seedling two months’ innocuous plants to Xylella fastidiosa were used. This study search for some relation into endogens cicadelid’s microorganism and symptomatic plants endophytes with CLS symptoms. The most abundant ground cicadelid (C7) was an effective vector to Xylella fastidiosa infection. The higher concentration of Xylella fastidiosa was usually found in the most abundant cicadelids populations. Petiole pierce method for Xylella fastidiosa mechanic infection was more effective (96.7%) than internode puncture (66.7%). The observation period in Xylella fastidiosa, Geobacillus spp and Pseudomonas fluorescens inoculated plants was not enough for CLS symptoms expression.