pH effects on the reaction catalyzed by Aspergillus fumigatus Siderophore A (AfSidA)

Abstract

Aspergilli is the name given to a family of saprophytic and ubiquitous fungus, that are important as industrial microorganisms, responsible of the large-scale production of several metabolites and enzymes. From this genus, Aspergillus fumigatus is one of the most important, because it is known as the leading mold pathogen in immunocompromised patients, causing aspergillosis, which is an infection that affects the respiratory system. Several studies revealed that one crucial step of the infection is the acquisition of nutrients, like iron, which availability in the human serum is really limited. For that reason, A. fumigatus biosynthesizes siderophores, to overcome the problem of limited iron accessible. For the synthesis of these molecules, A. fumigatus use an enzyme called N5-ornithine hydroxylase (AfSidA), which catalyzes the first committed step in the synthesis. The information of the enzyme is really limited, however the siderophore system have attracted much attention, so the enzyme, which represents a possible target for fungal therapies, that is why biochemical analysis are important. The principal objective was the evaluation in vitro of the enzymatic activity of the ornithine hydroxylase, by varying the concentration of selected compounds and pH. For these evaluations, AfSidA was first, expressed and purified; then according to the activity and stability of the enzyme in a series of buffers, a buffer system was selected to performed oxygen consumption assays, using constant concentrations of coenzyme, NADH 1mM, and enzyme, 2uM; and varying the concentrations of the selected substrates, L-ornithine and L-lysine. Also, an analysis of a possible effect caused by NADH was done. The results obtained in both profiles using the substrates were very similar, obtaining for the kcat profile one pK related to the formation of an active species, while in both kcat/KM profiles, two pKs were presented, the lower one representing the formation of an active species and the higher one, the transition to a less active species. In the case of the NADH profile, no uncoupling effect was observed, and tow ionizable groups were identified. The pKs resultants form the analysis can be highly related to a deprotonation on the substrates, leading to the formation of active specie, or the activation of the enzyme, when it reacts with NADH; and the protonation pKs can be linked to the formation of the protonated intermediate, C4a-peroxyflan.

Aspergillus es el nombre dado a una familia de hongos saprófitos y ubicuos, que son importantes en el área de la industria microbiológica ya que son responsables de la producción a gran escala de varios metabolitos y enzimas. De este género, Aspergillus fumigatus es uno de los más importantes, ya que es conocido como el agente patógeno líder en los pacientes inmunodeprimidos, causando la aspergilosis, que es una infección que afecta al sistema respiratorio. Varios estudios revelaron que un paso crucial de la infección es la adquisición de nutrientes, como hierro, cuya disponibilidad en el suero humano es muy limitada. Por esa razón, A. fumigatus biosintetiza sideróforos, para superar el problema de obtención hierro. Para la síntesis de estas moléculas, A. fumigatus hace uso de una enzima llamada N5 -ornitina hidroxilasa (AfSidA), que cataliza el primer paso comprometido en la síntesis. La información de la enzima es muy limitada, sin embargo, el sistema de sideróforo ha llamado mucho la atención, por lo tanto, la enzima, lo que representa un posible objetivo para las terapias de hongos, es por eso que los análisis bioquímicos son importantes. El objetivo principal fue la evaluación in vitro de la actividad enzimática de la ornitina hidroxilasa, variando la concentración de compuestos seleccionados y el pH. Para estas evaluaciones, primeramente, se expresó y purificó AfSidA, a continuación, de acuerdo con la actividad y la estabilidad de la enzima en una serie de buffers, un sistema de amortiguación fue seleccionad para realizar ensayos de consumo de oxígeno, con concentraciones constantes de coenzima NADH, 1 mM, y la enzima, 2µM, y variando las concentraciones de los sustratos seleccionados, L-ornitina y L-lisina. También un análisis de un posible efecto causado por el NADH se llevó a cabo. Los resultados obtenidos en los dos perfiles, usando los sustratos, fueron muy similares. En el perfil de kcat, se obtuvo un pK, relacionados con la formación de especie activa, mientras que en los perfiles de kcat/KM, dos pKs se presentaron, las más bajas representando la formación de especies activas y los valores más altos, la transición a una especie menos activa. En el caso del perfil de NADH, no se observó efecto de uncoupling, y dos grupos ionizables fueron identificados. Los pKs resultantes de los diferentes análisis pueden ser relacionados con una deprotonación de los sustratos, o a la activación de enzima; también se pueden relacionar los pKs de protonación a la formación del intermediario, C4a-peroxiflavina.