Crioconservación de especies leñosas

Abstract

La crioconservación (almacenamiento a ultra bajas temperaturas, nitrógeno líquido, NL, -196ºC) fue evaluada en tres especies leñosas de interés comercial: pilón (Hyeronima alchorneoides), especie de gran valor por su rápido crecimiento y calidad de su madera, con semilla recalcitratrante y problemas de reproducción natural; uña de gato (Uncaria tomentosa) utilizada para la producción comercial de alcaloides, en la cual el cultivo in vitro ha sido clave para la multiplicación y producción de líneas celulares y tempate (Jatropha curcas) especie leñosa no domesticada con semillas recalcitrantes y con potencial como cultivo bioenergético para la producción de biodiesel. En pilón, cuando se evaluó la técnica de encapsulamiento-deshidratación, el tratamiento que permitió la mayor sobrevivencia de los ápices consistió en el precultivo en medio suplementado con 0.3M sacarosa por un día y la deshidratación por 3.5 horas (humedad cercana al 21%) (88.60% de ápices verdes siete días después del ensayo). En el caso de la vitrificación, el protocolo más exitoso consistió en el precultivo por un día en 0.3M sacarosa seguido del tratamiento por 20 min con la solución de carga y 5 min con la solución vitrificadora PVS2 o PVS4 (92.62% y 88.74% respectivamente). No se observó superviviencia cuando se evaluó la técnica de encapsulamiento-vitrificación. En uña de gato, la vitrificación de los ápices utilizando la solución vitrificadora PVS2 permitió altos porcentajes de sobrevivencia después del congelamiento, siendo el tratamiento que consistió de precultivo en sacarosa por un día, la incubación en la solución de carga por 20 min, seguida de la incubación en PVS2 por 30 min el que permitió los mayores porcentajes (82%). Cuando se evaluó la técnica de encapsulamiento-deshidratación en los ápices, los porcentajes de sobrevivencia después del congelamiento fueron estadísticamente similares para todos los tratamientos 8 observándose valores entre 31,8 % para los ápices encapsulados sin precultivo en sacarosa y 52,8 % para los precultivados en 0,3 M y 0,4 M sacarosa, 24 h en cada concentración; sin embargo, los tratamientos presentaron baja regeneración después de las cuatro semanas de cultivo (10%). Por otra parte, la crioconservación de suspensiones celulares fue posible al utilizar la técnica de precultivo en 0,15M sacarosa por un día + 5% DMSO por 1h antes del congelamiento en NL (57,14% de sobrevivencia como formación de callos). Al crioconservar las semillas, aquellas que presentaban un contenido de humedad de aproximadamente 8,7 % lograron los mayores porcentajes de sobrevivencia y germinación. Tanto en suspensiones celulares como en semillas se utilizaron pruebas de tinción para evaluar la sobrevivencia, sin embargo, los resultados no correlacionaron con la evaluación del crecimiento celular y la germinación por lo que no se recomiendan como únicas pruebas. La crioconservación de semillas y embriones cigóticos de J. curcas fue realizada utilizando 2 metodologías; 1) la desecación e inmersión directa de las semillas en NL, y la desecación de embriones cigóticos en cámara de flujo laminar durante 0, 30 y 60 minutos, seguida de la inmersión en NL; 2) la vitrificación de embriones cigóticos. La germinación de las semillas después de su congelamiento a -196°C fue del 100%, la mejor respuesta en el desarrollo se logró cuando las semillas fueron inoculadas en arena. La respuesta de los embriones cigóticos a la crioconservación también fue muy exitosa alcanzando porcentajes de sobrevivencia del 100% si mostrar diferencias significativas entre los tratamientos. Sin embargo, el mejor desarrollo (100%) y longitud de las plántulas (51.77 mm) fue alcanzado cuando los embriones fueron sometidos un tiempo de secado de 60 minutos al flujo laminar. Aunque el uso de la técnica de vitrificación de embriones cigóticos no permitió ninguna señal de sobrevivencia después de la congelación en NL, los resultados graduales de sobrevivencia observados en cada una de las fases previas a la inmersión en NL, permiten ampliar el conocimiento sobre la tolerancia de estos embriones a las diferentes sustancias crioprotectoras y sus concentraciones y su efecto durante la congelación. Adicionalmente se afinó la metodología de micropropagación de tempate a partir de brotes vegetativos y segmentos de hoja. Otro de los logros del proyecto fue la incorporación de estudiantes a la investigación y la divulgación de los resultados en congresos científicos. Los resultados de la investigación se presentan en cinco capítulos: 1. Crioconservación de ápices de pilón (Hyeronima alchornoides), 2. Crioconservación de uña de gato (Uncaria tomentosa), 3. Crioconservación de semillas y embriones de tempate (Jatropha curcas), 4. Micropropagación de tempate (Jatropha curcas) y 5. Divulgación de resultados.