Evaluación de organismos quitinolíticos degradadores de sustratos de quitina-quitosano para biocontrol y biodegradación

Abstract

Los biomateriales son sustancias generadas por diversos mecanismos en la naturaleza, entre ellas están la celulosa, la lignina y la quitina. Se han hecho numerosos estudios para utilizar los organismos quitinolíticos como Biocontroladores por ser degradadores de la quitina; sin embargo, existe poca investigación al respecto y la evidencia de la utilidad de ciertas quitinasas en la degradación de exoesqueletos y hongos (Dahiya et al 2006). El presente trabajo de investigación se realizó con la finalidad de evaluar la acción de organismos quitinolíticos aislados de varios tipos de suelos que pueden ser utilizados en el Biocontrol o como degradadores de sustratos a base de quitina-quitosano. Se llevó a cabo en las instalaciones del Laboratorio de Biocontroladores del Centro de Investigación en Biotecnología (CIB) y en el Centro de Investigación de Servicios Químicos y Microbiológicos (CEQUIATEC) del ITCR en Cartago. Para el aislamiento de los microorganismos se emplearon muestras de suelo recolectadas en el año 2007 en cinco provincias de Costa Rica: Alajuela, Limón, Guanacaste, San José y Cartago tomadas a dos profundidades 0-10 cm y de 10-20 cm con 19 submuestreos para la obtención de 2 Kg de suelo/profundidad muestreada. A partir de las muestras colectadas, se obtuvo el aislamiento de cuatro bacterias con potencial quitinolítico, se identificaron tres de las bacterias aisladas como: Stenotrophomas maltophilia, Rhizombium radiobacter y Tsukamurella inchonensis, la cuarta se logró caracterizar como un bacilo Gram positivo esporulado móvil (BGP). Dos de los cuatro cultivos, T. inchonensis y BGP, iniciaron rápidamente el crecimiento exponencial, sin presentar una marcada fase de latencia, es posible que se acorte cuando las bacterias están en un cultivo rico en nutrientes y que suple los requerimientos básicos. El cultivo de T. inchonensis fue el que logró una mayor crecimiento bacteriano con 1.7000.000 células/ml de suspensión, seguido de BGP com 1.400.000 células/ml, luego S. maltophilia con 500.000 células/ml, por último R. radiobacter con 300.000 células/ml. En las pruebas preliminares de Biocontrol sobre Spodoptera frugiperda se observó que S. maltophilia demostró un potencial que coincide con lo citado por Zhang et al 2001. Para la especie T. inchonensis no se reportan estudios preliminares en los que se haya evaluado su capacidad productora de quitinasas que puedan potencializarlo como un posible microorganismo biocontroador de insectos. Se observó que la cepa de R. radiobacter fue la que presentó la mayor actividad quitinolítica seguida por S. maltophili; esto debido a que para el día cuarto después de la inoculación, tres mariposas ya habían emergido del sustrato, y para el día siete, la totalidad de las pupas asperjadas habían eclosionado, por lo que el porcentaje de emergencias se vio favorecido por la acción quitinolíticas de las bacterias. Finalmente se observó que al comparar la degradación de las membranas se puede decir que entre menos viscosidad de la mezcla, menor será el peso molecular promedio del quitosano entrecruzado; por lo tanto al producirse una disminución mayor de la viscosidad de la disolución de la membrana la degradación llevada a cabo por el microorganismo será mayor. No fue posible realizar la determinación del peso molecular promedio de las membranas, ya que el entrecruzamiento no permitió la formación de un hidrogel homogéneo, debido a su baja solubilidad, por lo que la medición de viscosidad no se pudo manejar como dato cuantitativo y solo se discutieron sus tendencias. Bajo las condiciones de cultivo en que se llevó a cabo el experimento se puede observar que T. inchonensis fue el microorganismo que realizó la mayor degradación, seguida por BGP y S. maltophilia. Mientras que de forma contraria a lo que se observó en las pruebas preliminares de Biocontrol R. radiobacter fue la que realizó la menor degradación. Este comportamiento corresponde a la tasa de crecimiento observada para las bacterias estudiadas. La mayor tasa de crecimiento la obtuvo T. inchonensis y la menor R. radiobacter lo que podría explicar el orden en la magnitud de la degradación.

Biomaterials are substances produced by different mechanisms in nature, which include cellulose, lignin and chitin. There have been numerous studies using chitinolytic organisms as biocontrol agents due to their degrading chitin characteristics, but there is little research and evidence about the usefulness of certain chitinases in the exoskeletons and fungal degradation (Dahiya et al 2006). This research was conducted in order to evaluate the action of chitinolytic organisms isolated from various soil types that can be used in the Biocontrol or substrates degrading chitin-chitosan base. The research was conducted on the premises of the Biotechnology Research Center (BRC) and the Research Center of Chemical and Microbiological Services (CEQUIATEC) ITCR in Cartago. The isolation of microorganisms were carried out using soil samples collected in 2007 in five provinces of Costa Rica: Alajuela, Limón, Guanacaste, San José and Cartago taken at two depths 0-10 cm and 10-20 cm with 19 sub- sampling to obtain 2 kg of soil / depth sampled. From the collected samples, we obtained the isolation of four potential chitinolytic bacteria, identified three of the isolated bacteria as Stenotrophomas maltophilia, Tsukamurella inchonensis and Rhizombium radiobacter, the fourth was characterized as a Gram positive sporulated Mobile (BGP). Two of the four cultures, T. inchonensis and BGP, quickly began growing exponentially, without showing a marked latency phase, it is possible to shorten when the bacteria are in a culture rich in nutrients that supply the basic requirements. The cultivation of T. inchonensis was the one who achieved a greater bacterial growth with 1.7000.000 cells / ml suspension, followed by com BGP 1,400,000 cells / ml, then S. maltophilia with 500,000 cells / ml, last R. radiobacter with 300,000 cells / ml. In preliminary tests on Spodoptera frugiperda Biocontrol found that S. maltophilia showed a potential that coincides with that found by Zhang et al 2001. For the species T. inchonensis there was not reported any preliminary studies that have evaluated its capacity to produce chitinases that may place it as a possible bio-controller microorganisms. It was noted that the strain of R. radiobacter was the one that showed the highest chitinolytic activity followed by S. maltophilia, this because for the fourth day after inoculation, three butterflies had emerged from the substrate, and by day seven, all sprayed pupae had hatched, so that the percentage of emergency was favored by the chitinolytic bacterial action. Finally it was noted that when comparing the degradation of the membranes, it can be said that the less viscosity of the mixture, the lower the average molecular weight of cross-linked chitosan. Therefore, a further decrease in the dissolution viscosity, it will be higher the membrane degradation carried out by the organism. It was not possible to determine the average molecular weight of the membranes, and that interbreeding did not allow the formation of a homogeneous hydrogel due to its low solubility, so the viscosity measurement could not be handled as quantitative data and only discussed trends was done. Under the conditions in which the experiment was conducted it was noted that T. inchonensis was the organism that made the most degradation, followed by BGP and S. maltophilia. On the other hand, it was observed that R. radiobacter was the one which made the least degradation. This behavior corresponds to the growth rate observed for the bacteria studied. The highest growth rate was obtained by T. inchonensis and the lowest R. radiobacter which could explain the order in the magnitude of degradation.