Funcionalización de electrodos de oro mediante la química EDC/NHS con aptámeros para biosensor impedimétrico con aplicación de detección de Brucella Abortus

Abstract

La siguiente investigación se realizó en el Laboratorio de Biotrónica en complemento con las instalaciones del Centro de Investigación y Extensión en Ingeniería en Materiales (CIEMTEC) y el Laboratorio Nacional de Nanotecnología (LANOTEC). La Brucella Abortus es la bacteria causante de la brucelosis, la cual es una enfermedad que puede transmitirse entre animales y humanos y que, según la Organización Mundial de la Salud (OMS), provoca hasta medio millón de casos anuales a nivel mundial. Este patógeno es responsable de abortos, disminución en la producción de leche y carne en los animales y genera pérdidas económicas en el sector ganadero de hasta $600 millones en América Latina. El objetivo principal del proyecto es desarrollar un método de funcionalización de electrodos de oro mediante la química EDC/NHS con aptámeros para el desarrollo de un dispositivo que permita la detección selectiva de Brucella Abortus. Inicialmente se realizan pruebas para la inmovilización de los aptámeros en distintos sustratos para demostrar la efectividad y la preparación adecuada de las superficies para realizar la funcionalización con el ácido mercaptopropiónico y la química de EDC/NHS que se complementan para permitir la fijación de los aptámeros. Por último, se realizó la caracterización de los chips de SiO2 y del electrodo de oro funcionalizados con los aptámeros mediante las técnicas de caracterización de espectroscopía: RAMAN, Infrarroja por Transformada de Fourier (FTIR) y de Impedancia Electroquímica (EIS), así como la Voltamperometría Cíclica (CV) y la Microscopía de Fuerza Atómica (AFM). Mediante AFM se notaron cambios importantes en la rugosidad de la superficie luego de la funcionalización con la química EDC/NHS, en la zona donde se notaron estos cambios se realizó un análisis de área mediante RAMAN el cual presentó señales de importancia que se asocian con los ácidos nucleicos. En complemento, el análisis FTIR respaldó la presencia de los grupos funcionales principales de los aptámeros, así como del MPA sobre la superficie de los chips ya funcionalizados. Con la CV y EIS se terminó de confirmar la inmovilización exitosa de los aptámeros sobre la superficie, se observó la disminución en los picos anódicos y catódicos que resaltan una menor reversibilidad de la reacción del electrolito con cada paso que se realizaba, mientras que los gráficos de Nyquist demostraron la adhesión efectiva de capas mediante el aumento de la impedancia en cada paso de la funcionalización.

The following research was carried out in the Biotronics Laboratory in complement with the facilities of the Materials Engineering Research and Extension Center (CIEMTEC) and the National Nanotechnology Laboratory (LANOTEC). Brucella Abortus is the bacterium that causes brucellosis, which is a disease that can be transmitted between animals and humans and which, according to the World Health Organization (WHO), causes up to half a million cases per year worldwide. This pathogen is responsible for abortions, decreased milk and meat production in animals and generates economic losses in the livestock sector of up to $600 million in Latin America. The main objective of the project is to develop a method of functionalization of gold electrodes by EDC/NHS chemistry with aptamers for the development of a device that allows the selective detection of Brucella Abortus. Initially, tests for the immobilization of aptamers on different substrates are performed to demonstrate the effectiveness and proper preparation of surfaces to perform the functionalization with mercaptopropionic acid and EDC/NHS chemistry complementing each other to enable aptamer binding. Finally, characterization of the SiO2 chips and gold electrode functionalized with the aptamers was performed using the spectroscopy characterization techniques: RAMAN, Fourier Transform Infrared (FTIR) and Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS), as well as Cyclic Voltammetry (CV) and Atomic Force Microscopy (AFM). By AFM, important changes in the surface roughness were noticed after functionalization with EDC/NHS chemistry, in the area where these changes were noticed an area analysis was performed by RAMAN which presented important signals associated with nucleic acids. In addition, FTIR analysis supported the presence of the main functional groups of the aptamers as well as MPA on the surface of the functionalized chips. With CV and EIS, the successful immobilization of the aptamers on the surface was confirmed, the decrease in the anodic and cathodic peaks was observed highlighting a lower reversibility of the electrolyte reaction with each step performed, while the Nyquist plots demonstrated the effective adhesion of layers by increasing the impedance at each step of the functionalization.