Escalamiento del cultivo de células en suspensión de Azadirachta Indica (NEEM) en biorreactor tanque agitado para la producción de Azadiractina

Abstract

Azadirachta indica is a tree known for its ability to synthesize secondary metabolites. Among these metabolites highlights azadirachtin (Aza), triterpenoid widely used as a potent natural insecticide. The production of this compound by traditional methods do not meet market demand and chemical synthesis is not yet possible due to the complexity of this molecule. Because of this, has been sought new biotechnological tools that make possible the production of azadirachtin. The objective of this project was to evaluate azadirachtin production in cell culture of Azadirachta indica in stirred tank bioreactor type. For this, cell suspensions were established from friable callus, induced from seeds collected in Bagaces, Guanacaste, Costa Rica, using as a growth regulator TDZ supplemented with hydrolyzed casein, allowing maximum growth of biomass 10,71mg / L in 18 days of culture. In addition, the cell suspensions were scaled to a volume of 3L stirred tank bioreactor type. It also evaluated the best solvent and extraction method. Methanol and stirring with temperature showed the best extraction coefficients. Through high-performance liquid chromatography (HPLC) field samples, plants in vitro and cell suspensions (in flask and bioreactor) were analyzed to quantify the amount of azadirachtin produced in different systems. There was a high production of azadirachtin in seed, reaching values of 18,4mg/g dry sample, whereas in field sheet was obtained 8,8mg / g dry. Additionally, in vitro leaf occurred 0.8mg / g. In vitro roots did not show quantifiable amounts of Aza by the method.ompounds quantifiable by the method employed. Cell suspensions in flasks, reached a maximum production of 167,85mg/L of culture, while in bioreactor was obtained 42,13mg/L. In both cases Aza production was directly related to biomass growth. The concentrations obtained by analyzing the material, suggesting the presence of elite material and, therefore, good production rates of Aza in vitro material. This allows to consider that the use of this biotechnological tool is viable to meet the demand of the compound on the market, considering that the process requires adjustments and optimizations.

Azadirachta indica es un árbol conocido por su capacidad de sintetizar metabolitos secundarios. Entre estos metabolitos destaca la azadiractina (Aza), triterpenoide ampliamente utilizado como un potente insecticida natural. La producción de este compuesto por métodos tradicionales no cumple con la demanda del mercado y la síntesis química aún no es posible, debido a la complejidad de esta molécula. Debido a ello, se ha buscado nuevas herramientas biotecnológicas que permitan la producción de azadiractina. El objetivo de este proyecto fue evaluar la producción de azadiractina en el cultivo celular de Azadirachta indica en biorreactor tipo tanque agitado. Para ello se establecieron suspensiones celulares a partir de callo friables, inducidos a partir de semillas colectadas en Bagaces, Guanacaste, Costa Rica, empleando como regulador de crecimiento el TDZ suplementado con caseína hidrolizada, lo cual permitió un crecimiento de biomasa máximo de 10,71mg/L en 18 días de cultivo. Además, las suspensiones celulares se escalaron a un volumen de 3L en un biorreactor tipo tanque agitado. Se evaluó, además, el mejor solvente y método de extracción, con lo cual el metanol y la agitación con temperatura mostraron los mejores coeficientes de extracción. Por medio de Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC por sus siglas en inglés) se analizaron muestras de campo, plantas in vitro y suspensiones celulares (en matraz y biorreactor) para cuantificar la cantidad de azadiractina producida en los diferentes sistemas, con lo cual se mostró una alta producción de azadiractina en semilla, alcanzando valores de 18,4mg/g seco de muestra, mientras que en hoja de campo se obtuvo 8,8mg/g seco. Adicionalmente, en hoja in vitro se produjo 0,8mg/g de Aza, mientras que las raíces in vitro no presentaron este compuesto en cantidades cuantificables por el método. En suspensiones celulares se alcanzó una producción máxima de 167,85mg/L de cultivo, mientras en biorreactor se obtuvo 42,13mg/L. En ambos casos la producción de Aza se relacionó directamente con el crecimiento en biomasa. Las concentraciones obtenidas al analizar el material sugieren la presencia de material élite en campo y, por ende, buenos rendimientos en la producción de Aza en material in vitro, lo cual perfila el uso de esta herramienta biotecnológica como viable para satisfacer la demanda del compuesto en el mercado, considerando la necesidad de realizar ajustes y optimizaciones del proceso